基本信息

概述

描述：细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。用荧光素标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。7-氨基放线菌素(7-AAD)是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。7-AAD只能透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜，因此将Annexin V和7-AAD联合使用，就可将凋亡早期、晚期及坏死细胞区分开来。
应用范围：FC

产品组分

在上述条件下，可稳定保存1年

实验范例

(A)未诱导Jurkat细胞 (B)用喜树碱（Camptothecin）诱导的Jurkat细胞， 按照说明书操作流程进行染色，用流式细胞仪检测结果。

操作流程

1. 根据实验要求，诱导细胞凋亡。
2. 用9ml 去离子水稀释1ml 10×Binding Buffer，配置成10ml 1×Binding Buffer，每次染色用2ml。
3. 离心收集细胞（1×10^6 个/ 次），用预冷的PBS 洗涤两次（300g 离心5min，弃上清）。对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS 洗涤。
4. 用1ml 1×Binding Buffer 重悬细胞，使细胞的密度达到1×10^6 个/ml。
5. 取100µl 细胞悬液（1×10^5 个）至5ml 流式管中。
6. 加入5µl Annexin V-FITC 和5µl 7-AAD，轻轻混匀。在室温（25℃）下避光孵育15min。
7. 加入400µl 1×Binding Buffer 轻轻混匀，在1 小时内用流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测

1. FITC激发波长Ex =494nm；发射波长Em =519nm，7-AAD激发波长 Ex =543nm；发射波长 Em =647nm
2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FL1通道检测；7-AAD的红色荧光通过FL3通道检测。

使用注意事项

1. Annexin V-FITC 和7-AAD 是光敏物质，请避光保存和使用。
2. 7-AAD 对人体有害，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
4. 细胞凋亡是一个快速过程，建议样品在染色后1 h 内进行上机分析。
5. 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，避免对细胞造成机械性损伤。
6. 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，7-AAD 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上PS 与Annexin V-FITC 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA 会影响Annexin V 与PS 的结合。
7. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V 结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA 的缓冲剂并在200 g 离心洗去血小板。
8. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节（可参考说明书附页“ 如何使用凋亡阳性诱导剂调节补偿”）。

常见问题与解决方案

Annexin V-FITC阳性率偏低或者染色失败
1. 首先要确定实验中使用的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照（可使用本试剂盒中的凋亡阳性诱导剂）来排除这一情况。
2. Annexin V-FITC 染色失败，最常见的实验操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+，Binding Buffer 中含有2.5 mM的Ca2+，含EDTA 的胰酶消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶。若使用含EDTA 的胰酶，必须通过洗涤步骤彻底去除EDTA。染色时，不可使用PBS 替代Binding Buffer。
3. 如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞也要收集，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。
4. 一些细胞其细胞膜上PS 的密度较低，染色效果很差，此时建议更换细胞株或者采用TUNEL 法检测凋亡。

假阳性
1. 实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后Annexin V-FITC/7-AAD双阳性比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力低。建议用台盼蓝染色计算细胞活力，未经药物处理的阴性对照台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若细胞活力低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少应传代2 - 3 次以后才能进行实验。
2. 可能是细胞操作不当引起，操作过程中吹打细胞过于剧烈，贴壁细胞消化过程中消化时间过长，均可能导致细胞膜破坏，出现假阳性。
3. 一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48 h 以上；诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。